Инновация - Выявление микобактерий туберкулёза и их устойчивости к различным группам антибиотиков

1. ПЦР в реальном времени: теория, варианты, возможности Развитие молекулярно - биологических технологий 1868 год – первые данные о химических свойствах ДНК Начало 50- годов XX в. – ДНК – это линейный полимер, состоящий из нуклеотидов, состоящих из азотистого основания, пентозы и фосфатной группы. Основания бывают двух типов: пуриновые – аденин и гуанин и пиримидиновые – цитозин и тимин. 1953 год – Д. Уотсон и Ф. Крик – нативная ДНК состоит из двух комплементарных полимерных цепей, образующих двойную спираль. Развитие молекулярно - биологических технологий 1955 год – Артур Корнберг – открытие в клетках фермента – ДНК-полимеразы. ДНК-полимеразы обеспечивают репарацию и репликацию ДНК. 1959 год – А. Корнберг и Северо Очоа – Нобелевская премия по физиологии и медицине «за открытие механизмов биологического синтеза рибонуклеиновой и дезоксирибонуклеиновой кислот». 1962 год – Дж.Уотсон, Ф.Крик и М.Уилкинс – Нобелевская премия по физиологии и медицине за установление молекулярной структуры нуклеиновых кислот и ее роли в передаче информации в живой материи. 1971 год – Клеппе и соавт. – данные, касающиеся состава ингредиентов реакционной смеси и принципы использования коротких искусственно синтезированных молекул ДНК-праймеров для получения новых копий ДНК. Начало 80-х годов – разработка автоматических синтезаторов ДНК. История Kary Mullis «Просто однажды ночью я наткнулся на решение» 1985 год - первая публикация, в которой использован метод ПЦР Kary Mullis и соавторов. Saiki, R.K., Scharf S, Faloona F, Mullis K.B., Horn G.T., Erlich HA, Arnheim N., 1985. Enzymatic amplification of b-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia, Science 230, 1350. 1993 год - Нобелевская премия в области химии Kary Mullis. 1992 год - первая публикация Higuchi и соавторов, в которой использован метод ПЦР в реальном времени. Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P.S., Griffith, R., 1992. Simultaneous amplification and detection of specific DNA-sequences. Bio-Тechnology 10(4), 413–417 Что такое ПЦР? Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - метод, имитирующий естественную репликацию ДНК, "in vitro" аналог биохимической реакции синтеза ДНК в клетке. ПЦР позволяет найти в исследуемом материале небольшой участок генетической информации, заключенный в специфической последовательности нуклеотидов ДНК любого организма среди огромного количества других участков ДНК и многократно размножить его. ПЦР позволяет получить количество ДНК, достаточное для детекции. Область применения: диагностика инфекционных заболеваний; диагностика онкологических заболеваний; диагностика генетических заболеваний; идентификация личности; диагностика патогенов в пище; диагностика ГМО и др. Схема ПЦР ПЦР – циклический процесс, каждый цикл которого включает в себя три этапа, характеризующихся определенной продолжительностью и температурным режимом. ПЦР: состав реакционной смеси 1. Целевая ДНК из образца любой природы (известная нуклеотидная последовательность) - ПЦР-мишень, которая будет многократно копироваться в ходе реакции. 2. Праймеры – 2 искуственно синтезированных фрагмента ДНК, комплементарные районам, находящимся на противоположных нитях и фланкирующим искомую ДНК-мишень, с праймеров начинается удваивание цепи ДНК. ПЦР: состав реакционной смеси 3. Термостабильная ДНК- полимераза – фермент, способный удлинять цепь ДНК.4. Дезоксинуклеотидтрифосфаты (дАТФ, дТТФ, дЦТФ, дГТФ) – «строительный материал» для синтеза комплементарной цепи ДНК.5. Реакционный буфер (с Mg2+) – буфер, создающий оптимальные условия (концентрация ионов и рН) для работы ДНК-полимеразы. Виды детеции ПЦР - амплификации Электрофорез в агарозном геле Детекция методом электрофореза в агарозном геле (только по конечной точке): разделение заряженных молекул (ДНК) в пористом геле в зависимости от их размера под действием электрического поля ДНК (ампликон) имеет отрицательный заряд - в электрическом поле движется от «-» к «+» Молекулы ДНК разного размера имеют различную подвижность в агарозном геле Размер ампликона можно оценить, сравнив его пробег с пробегом молекул ДНК известной длины Электрофорез в агарозном геле Преимущества: 1. Не требуется сложного оборудования2. Низкая стоимость реактивов Недостатки: 1. Высокий риск контаминации (загрязнения продуктами предыдущих ПЦР)2. Требуется дополнительное помещение и персонал для стадии детекции продукта3. Трудоемкость4. Только качественный анализ (есть/нет) Флуоресцентный метод детекции Флуоресцентный метод детекции по конечной точке (FLASH): пробирки с продуктами ПЦР анализируются специальным флуоресцентным детектором. Преимущества: 1. Низкая стоимость оборудования для детекции2. Низкая трудоемкость3. Не требуется дополнительного помещения и персонала4. Снижение риска контаминации5. Автоматическая регистрация и интерпретация данных Недостатки: 1. Только качественный анализ (есть/нет)2. Более дорогие реактивы (по сравнению с форезом) Что такое ПЦР в реальном времени (real-time PCR) ? Флуоресцентный метод детекции в режиме реального времени(real-time PCR): Определение выхода продукта после каждого цикла амплификации Построение по этим данным кинетической кривой ПЦР Определение относительной концентрации субстрата на основании анализа этой кривой Стадия детекции совмещена со стадией амплификации. Кинетические кривые ПЦР в реальном времени Кинетическая кривая ПЦР в координатах "Уровень флуоресценции — цикл амплификации" имеет сигмоидную форму. В ней можно выделить три стадии: Стадию инициации (когда ПЦР-продукты еще не детектируются флуоресцентной меткой); Экспоненциальную стадию (в которой наблюдается экспоненциальная зависимость количества флуоресценции от цикла ПЦР);Плато (стадию насыщения). Пороговый цикл (threshold cycle, C(T)) такой цикл n, на котором достигается некий заданный уровень флуоресценции – пороговая флуоресценция. Значение С(T) прямо пропорционально логарифму количества субстрата. ПЦР-РВ позволяет сравнивать количества субстрата при условии, что эффективность реакции и заданный уровень пороговой флуоресценции одинаковы для каждой из сравниваемых реакций. Сравнение ПЦР и ПЦР - РВ Флуоресцентные зонды Делятся на две категории: использующие неструктурированные линейные зонды (TaqManTM, LightCycler, Lanthanide, EclipseTM); использующие структурные зонды (Molecular Beacons, ScorpionsTM , CycliconsTM). красители на 5’ и 3’ концах зонда один из красителей внутри цепи ( натимидине или цитидине) Преимущества и недостатки систем ПЦР-РВ со специфической детекцией Преимущества систем, использующих флуоресцентные олигонуклеотидные зонды: специфичность не ограничивается специфичностью праймеров, дополнительная специфичность за счет комплементарного зонда; возможность проведения мультиплексной ПЦР (до 4-х красителей); огромный выбор вариантов ПЦР-РВ. Недостатки: сложный дизайн зондов и праймеров; высокая стоимость, т.к. на каждый фрагмент требуется свой специфический зонд. Преимущества ПЦР-РВ Основныепреимущества измерение исходного количества специфической ДНК (РНК) в исследуемом образце; широкий динамический диапазон от единичных до 109 копий; возможность сравнительного количественного анализа для нескольких различных ДНК-мишеней в одной пробирке одновременно; обнаружение и определение процентного содержания ДНК с измененной последовательностью; исключение послеамплификационных манипуляций с продуктом, и, как следствие, существенное снижение риска контаминации, сокращение времени анализа, упрощение организации ПЦР лаборатории; автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов. Что необходимо для работы по технологии ПЦР в реальном времени: прибор для ПЦР-РВ; программное обеспечение; реактивы – наборы, тест-системы, праймеры и зонды; вспомогательное оборудование – центрифуги, вортексы, ламинар; расходные материалы – пробирки, стрипы, плашки. 2. Определение антибиотикоустойчивости Особенности МБТ медленная скорость роста возбудителей; внутриклеточная локализация; высокая плотность (концентрация) клеток патогена (М.tuberculosis) в пораженном органе – до 10 млрд на легкое; способность клеток к переходу в фазу отсутствия роста с реактивацией через несколько лет; природная резистентность к ряду антимикробных агентов. Все это приводит к хронической инфекции с необходимостью поддержания высокого уровня лекарственных препаратов в организме больного в течение ряда месяцев, в связи с чем обостряется проблема токсичности используемых лекарств. Виды антибиотикоустойчивости Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ или MDR – Multi-Drug Resistance) – вид устойчивости МБТ к двум основным ПТП – изониазиду и рифампицину одновременно (независимо от наличия резистентности к др. препаратам). 450,000 новых случаев туберкулеза с МЛУ - ежегодно. Экстенсивная или широкая лекарственная устойчивость – (XDR – Extensively Drug Resistant) множественная лекарственная устойчивость в сочетании с устойчивостью к фторхинолонам и к одному из группы инъекционных препаратов: канамицину или/и амикацину или/и капреомицину. 27,000 новых XDR случаев туберкулеза - ежегодно. Лечение XDR туберкулеза крайне трудно. Экстремальная или абсолютная лекарственная устойчивость – (XXDR – Extremely Drug Resistant) – устойчивость ко всем ПТП. В 2007 г. - первая публикация о двух зарегистрированных случаях абсолютно устойчивого туберкулеза (XXDR) в Италии. Перекрестная лекарственная устойчивость – явление, когда возникновение устойчивости к одному препарату влечет за собой устойчивость к другим ПТП. Обусловлена сходством химической структуры некоторых ПТП. Диагностика лекарственной чувствительности/устойчивости Классические Абсолютных концентраций Пропорций Метод коэффициента резистентности «Ускоренные» методы Бактек-960 (пропорций) Молекулярно – генетические ПЦР в реальном времени Биочип-технология Hain-test MDR-TB GeneXpert Определение антибиотикоустойчивости с помощью ПЦР-РВ Определение лекарственной чувствительности с помощью ПЦР-РВ – определение генных мутаций, ассоциирующихся с устойчивостью к определенным противотуберкулезным препаратам. Аллель-специфичная ПЦР: для эффективной ПЦР 3’-концевой нуклеотид праймера должен быть комплементарен соответствующему нуклеотиду ДНК-матрицы, иначе эффективность удлинения праймера во время ПЦР резко снижается или может отсутствовать совсем. Преимущество АС-ПЦР: позволяет получать информацию не только о наличии мутации в геномной ДНК, но и ее аллельном распределении. АС-ПЦР в формате реального времени – возможность одностадийного быстрого и точного анализа мутаций ! Схема метода определения мутаций на основе технологии аллель-специфичной ПЦР-РВ Интерпретация результатов выявления мутаций на примере 531 кодона rpoB гена M.tuberculosis Апробация технологии мультиконкурентной аллель-специфичной ПЦР 2005 г. – испытания шифрованных тест-культур из супранациональной лаборатории Швеции; 2008-2009 гг. – ФСВОК испытания панели образцов на антибиотикоустойчивость 2006 г. – мониторинг более 2000 клинических образцов культур из 25 регионов РФ 2007 г. – клинические испытания шифрованных образцов мокроты 2007-2008 г. – регистрация в ГИСК им. Тарасевича 2007-2008 г. – разработка тест-систем, определяющих устойчивость к фторхинолонам, капреомицину, амикацину 2010 г. – получены регистрационные удостоверения на наборы М-СОРБ-ТУБ, АМПЛИТУБ-РВ, АМПЛИТУБ-МЛУ-РВ Результаты мониторинга лекарственной устойчивости по федеральным округам РФ Сравнение ПЦР-РВ анализа и бактериологического исследования лекарственной устойчивости к RMP и INH Совпадение результатов ПЦР-РВ и метода пропорций 99.5% Апробация технологии мультиконкурентной аллель-специфичной ПЦР-РВ Разработанный метод мультиконкурентной аллель-специфичной ПЦР-РВ позволяет быстро (1-3 дня) определять антибиотикоустойчивость 90-100% потенциально устойчивых штаммов со специфичностью 99-100%. Результаты сравнительных испытаний Уровень совпадений результатов определения лекарственной чувствительности между культуральными исследованиями и методом ПЦР-РВ составил: по двум типам антибиотиков (фторхинолоны и капреомицин/амикацин) – 87% по фторхинолонам – 84,1%; по капреомицин/амикацину – 89,6 %. Чувствительность анализа методом ПЦР-РВ, по сравнению с культуральным, составила 90% (фторхинолоны - 90%, капреомицин/амикацин – 90%). Специфичность анализа – 98% (фторхинолоны - 96%, капреомицин/амикацин – 100%). ПЦР-РВ технология возможность работы как с культурами, так и с клиническими образцами высокая специфичность метода позволяет анализировать смешанные штаммы автоматический расчет результатов анализа с указанием количества выявленного возбудителя в образце и конкретных мутаций, определяющих устойчивость к определенным препаратам открытая система (возможность использования реагентов разных производителей, возможность использования материала для всех задач комплексного анализа МБТ) требует 2 помещений при организации ПЦР-лаборатории Выделение ДНК на примере реагентов производства компании Синтол «М-СОРБ-ТУБ» для для ручного выделения ДНК Сочетает сорбцию ДНК на магнитных частицах и осаждение ДНК в присутствии осаждающего реагента, специально разработан для выделения туберкулезной ДНК из клинического материала. «М-СОРБ-ТУБ-АВТОМАТ» для автоматического выделения ДНК Адаптирован для автоматического выделения ДНК микобактерий на роботизированных станциях TECAN Выделение ДНК – на роботизированной станции TECAN снижает риск контаминации во время выделения практически до нуля существенно уменьшает трудоемкость процесса выделения экономически эффективная система (низкий расход пластика и реактивов) позволяет проводить стандартизированное выделение ДНК из клинических образцов специально разработан для выделения ДНК микобактерий из клинического материала и культуры клеток обеспечивает высокую эффективность выделения ДНК из клинических образцов мокроты выделение ДНК основано на сорбции ДНК на оригинальных магнитных частицах включает внутренний положительный контроль (ВПК), позволяющий контролировать ингибирование ПЦР-РВ и эффективность выделения Заключение В настоящий момент в Российской Федерации, согласно Приказу № 109 министерства здравоохранения, подтверждение диагноза для всех случаев туберкулеза, так же как и контроль эффективности лечения (ежемесячно), осуществляется методом посева. Основным недостатком метода являются длительные сроки получения результатов (21-28 суток), обусловленные медленным ростом микобактериальной популяции. Метод ПЦР позволяет за короткое время (несколько часов) провести одновременно качественный и количественный анализ как на сами микобактерии туберкулёза, так и на их лекарственную устойчивость. Однако, постановка ПЦР анализа имеет высокие требования к чистоте эксперимента и профессионализму сотрудников. Автоматическая роботизированная станция TECAN позволяет избежать многих трудностей возникающих на преаналитическом этапе, снизить до минимума риск контаминации и практически исключить «человеческий фактор».